Au XVIe siècle, d’abord en Italie puis dans le reste de l’Europe, les représentations de Chasse à la licorne se font plus rares. La blanche bête est toujours représentée aux côtés d’une jeune et belle dame, mais leur relation est désormais confiante et apaisée. La licorne perd sa signification allégorique pour n’être plus qu’un attribut de la chasteté, de la pureté.
La plupart de ces peintures sont des portraits de dames. La licorne qui les accompagne figure leur vertu, avec peut-être parfois une pointe d’ironie, puisque les trois derniers tableaux représentent sans doute Giulia Farnese, qui n’était pas réputée pour sa chasteté.
Sur les tableaux, la licorne symbole de virginité, ou du moins de pureté, peut aussi se faire plus discrète. Quand on la voit sur un tombeau alors qu’elle ne supporte habituellement pas les armes familiales, c’est souvent pour figurer la pureté d’une fille morte trop jeune.
La licorne symbolise encore la chasteté dans un contexte chrétien, comme dans les nombreuses représentations des vertus, mais se retrouve aussi associée à des vierges qui n’ont rien de chrétien, comme Diane ou les vestales.